O conhecimento sobre a fotossíntese e seus fatores limitantes é essencial para enfrentar os desafios ambientais contemporâneos. Nessa perspectiva, o ensino da fotossíntese deve ser capaz de permitir aos estudantes compreenderem não apenas a relevância desse processo para a manutenção da vida na Terra, como também de que maneira o homem pode interferir e limitar as reações fotossintéticas. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo promover construção de conhecimentos sobre a influência do efeito estufa na fotossíntese a partir de uma Sequência de Ensino Investigativa (SEI). A atividade foi desenvolvida com estudantes do primeiro ano do Ensino Médio de uma escola pública municipal localizada em Cabo Frio - RJ. A partir de uma metodologia com abordagem qualitativa, a SEI foi realizada em três aulas e contou com as seguintes etapas: (1) identificação das concepções dos estudantes; (2) atividade utilizando um simulador virtual; (3) atividade prática experimental, e (4) análise e discussão final. A coleta de dados foi conduzida a partir da observação direta dos estudantes e das informações registradas nas atividades investigativas. Os resultados obtidos evidenciaram o efeito negativo do excesso de gás carbônico e da alta temperatura sobre o processo fotossintético. Outrossim, a realização da SEI possibilitou o protagonismo estudantil na produção de saberes sobre a fotossíntese, além de ter sido capaz de contribuir para a alfabetização científica dos estudantes, a partir da observação, da proposição de hipóteses, da investigação e da argumentação. Dessa forma, a atividade colaborou para o desenvolvimento do pensamento científico e crítico, bem como para a formação de cidadãos mais conscientes sobre a importância da preservação ambiental e do uso sustentável dos recursos naturais.